Krystyna Bielnik*, Dariusz Młoczkowski*, Stefan Szram**
Zmiany ultrastrukturalne w mięśniu serca szczurów narażonych na długotrwałe
spożywanie glikolu etylenowego w niskich dawkach
Myocardial ultrastructural changes in rats exposed to long ethylene glycol
intake
* Z Katedry Patomorfologii Klinicznej WAM w Łodzi
Kierownik Katedry: prof. dr hab. med. K.W. Zieliński
** Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM Łodzi
Kierownik Katedry: prof. dr hab. med. S. Szram
Eksperyment przeprowadzono na 80-ciu szczurach szczepu wsobnego Wistar, którym
podawano do picia 1,25% roztwór glikolu etylenowego przez 16 tygodni. Dokonano
oceny mięśnia serca w mikroskopie świetlnym i elektronowym po 12, 14 i 26 tygodniach
trwania doświadczenia. W miarę upływu czasu zaobserwowano zmiany morfologiczne
zarówno w obrębie struktury włókien mięśniowych, jak i przestrzeni śródmiąższowej.
Początkowo występował obrzęk w przestrzeni śródmiąższowej, następnie pojawiły
się fibroblasty tworzące kolagen. Zmiany w komórkach dotyczyły nasilenia funkcji
autosomalnej, kondensacji mitochondriów oraz wydzielania uszkodzonych organelli
komórkowych przez nieuszkodzoną sarkolemmę.
Experiments were carried out in 80 Wistar rats who were given a 1,25% ethylene
glycol solution to drink for 16 weeks. Myocardium was estimated by light and
electron microscope after 12, 14, and 16 weeks of the experiment. As time passed
morphological changes were observed both within the muscle fibres and interstitial
space. Initially, oedema in the interstital space was found, then collagen forming
fibroblasts appeared. Changes in muscle cells were related to intensification
of lysosome autophagosomal function, mitochondria condensation and damaged cell
organelle secretion outside the intact sarcolemma.
Słowa kluczowe: serce, glikol etylenowy, przewlekła intoksykacja, morfologia,
ultrastruktura.
Key words: heart, ethylene glycol, chronic intoxication, morphology, ultrastructure.
Wstęp
Glikol etylenowy (GE) jest alkoholem dwuwodorotlenowym o własnościach fizyko-chemicznych
zbliżonych do gliceryny. Jest powszechnie stosowany jako główny składnik chłodziwa
w motoryzacji i pojazdach kosmicznych, dodatek do produkcji farb, lakierów,
środków farmaceutycznych, kosmetyków, a także jako środek konserwujący w przemyśle
spożywczym.
Stosunkowo często spotykamy się z ostrymi zatruciami tą substancją, po spożyciu
celowym lub pomyłkowym. Postać ostrego zatrucia GE jest dość dobrze poznana
i opisana. Jednak ze względu na szeroki wachlarz produktów zawierających GE
dostępnych na rynku istnieje możliwość powstawania przewlekłych zatruć tą substancją
(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).
Celem naszej pracy jest przedstawienie zmian ultrastrukturalnych w mięśniu
serca szczurów narażonych na przewlekłe spożywanie GE.
Metodyka
Doświadczenie przeprowadzono na 80 szczurach szczepu wsobnego Wistar (40 samców
i 40 samic), w wieku 5-ciu m-cy i ciężarze ciała 150-180g. Zwierzęta podzielono
na dwie grupy doświadczalną D (60 zwierząt) i kontrolną K (20 zwierząt). Szczurom
grupy K podawano paszę Murigran i wodę pitną w dowolnej ilości. Zwierzęta
grupy doświadczalnej otrzymywały paszę Murigran oraz wodę pitną w dowolnej ilości
z dodatkiem glikolu etylenowego w postaci roztworu o stężeniu 1,25%. Stężenie
to zostało ustalone we wstępnym badaniu pilotowym. Zwierzęta uśmiercano w ogólnym
znieczuleniu eterowym przez otwarcie klatki piersiowej, w 12, 14 i 16 tygodniu
trwania eksperymentu. Wycinki pobrane z mięśnia prawej i lewej komory serca
utrwalano w 3,6% glutaraldehydzie w 0,13 M buforze kakodylowym o pH 7,2. Po
dotrwaleniu w 2% roztworze czterotlenku osmu materiał zatapiano w Eponie. Preparaty
krojono ultramikrotomem LKB-5, siatki kontrastowano w automacie Ultrastein-LKB
i oceniano w mikroskopie elektronowym 10 CR Zeiss. Wycinki pobrane do badań
histologicznych w mikroskopie świetlnym utrwalano w 10% roztworze zobojętnionej
formaliny, następnie opracowywano w procesorze tkankowym Hypocenter-Shandon.
Bloczki parafinowe krojono na skrawki grubości 4 mikronów, barwiono hematoksyliną
i eozyną oraz wykonano odczyny histochemiczne metodą Selye`go i Massona.
Wyniki badań
1. Obserwacja kliniczna zwierząt doświadczalnych w czasie trwania eksperymentu.
W czasie trwania doświadczenia zachowanie się zwierząt grupy kontrolnej i grup
doświadczalnych było podobne.
2. Wyniki badań morfologicznych w mikroskopie świetlnym.
W wycinkach z serc zwierząt doświadczalnych po 12 tygodniach doświadczenia
stwierdzono obrzęk śródmiąższowy z poszerzeniem przestrzeni międzykomórkowych
i okołonaczyniowych. Po 14 tygodniach obrzęk utrzymywał się oraz można było
zaobserwować w tych miejscach obecność substancji o strukturze włókienkowej.
Po dalszych dwóch tygodniach w przestrzeniach okołonaczyniowych widoczne były
dojrzałe włókna kolagenowe. Włókna mięśniowe wykazywały cechy niewielkiego przerostu.
W żadnym przypadku nie stwierdzono natomiast zjawiska oksalozy obserwowanej
przez innych autorów (8).
3. Wyniki badań morfologicznych w mikroskopie elektronowym.
W mięśniu serca szczurów doświadczalnych po 12 tygodniach trwania eksperymentu
stwierdzono obrzęk śródmiąższowy w postaci poszerzenia przestrzeni międzykomórkowych
i okołonaczyniowych, z obecnością substancji o niskiej gęstości elektronowej
wykazującej strukturę drobnoziarnistą, wśród której ogniskowo widoczne były
pojedyncze fibroblasty, włókna kolagenowe o chaotycznym układzie oraz wydzielone
poza sarkolemmę uszkodzone organella komórkowe, głównie mitochondria (ryc. 1,
2). W strukturze aparatu kurczliwego, jąder komórkowych miocytów, mitochondriów,
kanałów siateczki śródplazmatycznej, sarkolemmy i wstawek nie stwierdzono istotnych
zmian w porównaniu z grupą kontrolną.
Po 14 tygodniach trwania eksperymentu zaobserwowano zwiększenie liczby lizosomów
(autofagosomów) wśród skupisk mitochondriów oraz w pobliżu jąder komórkowych
miocytów. W dalszym ciągu utrzymywał się obrzęk śródmiąższowy, a substancja
zawarta w przestrzeniach okołonaczyniowych i międzykomórkowych wykazywała większą
gęstość elektronową w porównaniu do zwierząt grupy poprzedniej. Wśród tej substancji
widoczne były pojedyncze fibroblasty, a także opisane wyżej uszkodzone
struktury błoniaste. Stwierdzono również zwiększenie obszarów zawierających
włókna kolagenowe. Stopień dojrzałości tych włókien był wyższy niż w grupie
poprzedniej. W pozostałych elementach strukturalnych miocytów nie obserwowano
istotnych zmian patologicznych.
W grupie zwierząt uśmierconych po 16 tygodniach trwania doświadczenia w strukturze
mięśnia serca widoczne były bardzo istotne zmiany. W przestrzeniach międzykomórkowych
i okołonaczyniowych stwierdzono obecność kolagenu o różnym stopniu dojrzałości,
od typu III-ciego do I-szego (ryc. 3). W znacznie poszerzonych przestrzeniach
międzykomórkowych widoczne były liczne struktury błoniaste o różnym stopniu
destrukcji oraz nieliczne fibrocyty. Nadal utrzymywała się zwiększona ilość
autofagosomów w obrębie włókien mięśniowych (ryc. 4). Niektóre mitochondria
posiadały zwielokrotnioną ilość błon, a większość z nich miała zagęszczoną strukturę
wewnętrzną, świadczącą o przejściu do stanu skondensowanego. W pojedynczych
włóknach widoczne były uszkodzone łącza międzykomórkowe w postaci odcinkowego
rozsunięcia brzegów wstawek (ryc. 5). W nielicznych włóknach mięśniowych stwierdzono
marginalizację chromatyny jąder komórkowych. w żadnym przypadku nie zaobserwowano
obecności kryształów szczwianów wapnia w tkankach.
Ryc. 1. Wycinek z serca szczura po 12 tygodniach intoksykacji. Elektronogram
pow.10 000x. Poszerzona przestrzeń okołonaczyniowa (PS) zawierająca materiał
o niewielkiej gęstości elektronowej i wydzielone poza komórkę uszkodzone
struktury błoniaste (MS). Struktura aparatu kurczliwego prawidłowo utrzymana.
Fig. 1. Rat heart specimen 12 weeks after intoxication. Electronogram
enl. 10 000x. Dilated perivascular space (PS) containing material of
slight electron density and damaged membranous structures (MS) secreted
beyond the cell. Maintained regular structure of contractile apparatus.
Ryc. 2. Wycinek z serca szczura po 12 tygodniach intoksykacji. Elektronogram
pow. 10 000 x. W poszerzonej przestrzeni okołonaczyniowej (PS) obecne delikatne
włókna kolagenowe (COL) o chaotycznym układzie.
Fig. 2. Rat heart specimen 12 weeks after intoxication. Electronogram
enl. 10 000x. Delicate collagen fibres (COL) in chaotic arrangement
found in the dilated perivascular space (PS).
Ryc. 3. Wycinek z serca szczura po 16 tygodniach intoksykacji. Elektronogram
pow. 10 000 x. W przestrzeni okołonaczyniowej obecny dojrzały kolagen (COL).
Struktura włókien mięśniowych (M) i połączenia międzykomórkowego (C) prawidłowo
utrzymana.
Fig. 3. Rat heart specimen 16 weeks after intoxication. Electronogram
enl. 10 000x. Mature collagen (COL) found in the parivascular space.
Mainted regular structure of muscle fibres (M) and intercellular connection
(C).
Ryc. 4. Wycinek z serca szczura po 16 tygodniach intoksykacji. Elektronogram
pow. 10 000 x. Autofagosomy (A) w sąsiedztwie jądra (N) komórkowego włókna
mięśniowego.
Fig. 4. Rat heart specimen 16 weeks after intoxication. Electronogram
enl. 10 000x. Autophagosomes (A) in the neigbourhood of muscle fibre
nucleus (N).
Ryc. 5. Wycinek z serca szczura po 16 tygodniach intoksykacji. Elektronogram
pow. 10 000 x. Rozsunięcie brzegów wstawki (C) (połączenia między włóknami mięśniowymi).
Fig. 5. Rat heart specimen 16 weeks after intoxication. Electronogram
enl. 10 000x. Separation of the connection edge (C) (between muscle
fibre connection).
Omówienie wyników badań
Stosowanie w sposób przewlekły małych dawek glikolu etylenowego w istotny
sposób wpływa na strukturę mięśnia serca. Pojawiają się zaburzenia struktury
wewnętrznej włókien mięśniowych, a także narastają procesy włóknienia śródmiąższowego.
Procesy destrukcyjne występują jednocześnie z próbami utrzymania prawidłowej
homeostazy włókna mięśniowego, o czym świadczą znacznie nasilone procesy uprzątania
i egzocytozy. Efektywność tych procesów jest ściśle uzależniona od prawidłowej
perfuzji naczyniowej i dyfuzji pomiędzy krwią a włóknem mięśniowym. Narastające
w czasie zjawisko włóknienia ma charakter nieodwracalny i niewątpliwie wpływa
niekorzystnie na procesy ukrwienia zarówno pojedynczych włókien, jak i serca
jako całości.
Dyskusja
Zjawiska patologiczne występujące w strukturze mięśnia serca zwierząt doświadczalnych
składają się na obraz kardiomiopatii wtórnej. Może mieć to związek z działaniem
w sposób ciągły bardzo toksycznych metabolitów glikolu etylenowego. Jak wynika
z danych z piśmiennictwa glikol etylenowy wywiera bezpośredni narkotyczny wpływ
na komórki ośrodkowego układu nerwowego, w czym przypomina działanie alkoholu
etylowego (5). Natomiast nie wpływa ujemnie na oddychanie komórkowe, cykl kwasów
karboksylowych oraz inne szlaki metaboliczne organizmów żywych. (5, 9) Metabolizm
glikolu etylenowego odbywa się w mitochondriach, głównie wątroby i nerek.
W procesach utleniania powstają takie substancje o charakterze aldehydowym jak:
aldehyd glikolowy kwas glikolowy i kwas glioksalowy. Związki te hamuja
oddychanie komórkowe i procesy oksydatywnej fosforylacji, blokuja dehydrogenazę
alfa-ketoglutarową i izocytrynianową, hamują syntezę białek, replikację DNA
i syntezę rybosomalnego RNA (5, 9, 10). Końcowym produktem degradacji GE jest
kwas szczawiowy uznawany za potencjalną nefrotoksynę (6, 10, 11). W naszych
badaniach nie stwierdziliśmy obecności szczawianów wapnia w żadnej tkance, w tym
także w nerkach. Prawdopodobnie ilość ich, związana z niską dawką toksyny była
zbyt mała do powstania oksalozy tkankowej spotykanej w przebiegu ostrego zatrucia
wysokimi dawkami GE. Wszystkie produkty degradacji wywołują kwasicę metaboliczna
(9, 10, 12, 13, 14). Kwasica metaboliczna powoduje między innymi blokowanie
tzw. powolnego kanału wapniowego w błonie komórkowej włókien mięśnia serca (15).
Metabolity GE poprzez wpływ na procesy oddychania komórkowego zaburzają procesy
utleniania tkankowego i prawdopodobnie z tym należy wiązać powstawanie
zmian strukturalnych mięśnia serca podobnych do obserwowanych w kardiomiopatii
niedokrwiennej lub poalkoholowej (7, 16, 17, 18).
Pojawienie się kolagenu w przestrzeniach wokół naczyń wieńcowych mięśnia serca
i narastanie jego ilośći w czasie trwania naszego eksperymentu wydłuża drogę
dyfuzji tlenu, a tym samym powoduje dalsze pogłębienie deficytu tlenowego na
poziomie komórkowym.
Piśmiennictwo
1. Bobbit W. H., Wiliams R. M., Freed C. R.,: Severe ethylene glycol intoxication
with multisystem failure. West. J. Med. 1986, 144, 225. -2. Cathings T. T.,
Beamer W. C., Lundy L., Prough D. S.: Adult respiratory distress syndrome secondary
to ethylene glycol ingestion. Ann. Emerg. Med. 1985, 14, 594. -3. Darosa R.,
Henning R. J., Sunshine I., Sutheimer C.: Acute ethylene glycol poisoning. Crit.
Care Med. 1984, 12, 1003. -4. Frommer J. P., Ayus J. C.: Acute ethylene glycol
intoxication. Am. J. Nephrol. 1982, 2, 1. -5. Parry M. F., Wallach R.: Ethylene
glycol poisoning. Am. J. Med. 1974, 57, 143. -6. Turk J., Morrel L., Avioli
L. V.: Ethylene glycol intoxication. Arch. Int. Med. 1986, 146, 1601. -7. Verilli
M. R., Deyling C. L., Pippenger C. E., van Lente F., Vidt D. G., Sivak E. D.:
Fatal ethylene glycol intoxication. Raport of case and review of the literature.
Cleve. Clin. J. Med. 1987, 54, 289. -8. Nizze H., Schwabbauer P., Brachwitz
C., Lange H.: Fatal chronic oxallosis after sublethal ethylene glycol poisoning.
Pathologie 1997 18 (4), 328. -9. Bachman E., Golberg L.: Reapraisal of the toxicology
of ethylene glycol III: Mitochondrial Effects. Fd. Cosmet. Toxicol 1971, 9,
39. -10. Jacobsen d., Ovrebo S., Ostborg., Sejersted D. M.: Glikolate causes
the acidosis in ethylene glycol poisoning and its effectlively removed by hemodialysis.
Acta Med. Scand. 1984, 216, 409.
11. Levy R. J.: Renal failure secondary to ethylene glycol intoxication. JAMA
1960, 173, 1210. -12. Clay K. L., Murphy R. C.: On the metabolic acidosis on
ethylene glycol intoxication. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1977, 39, 39. -13. Gabow
P. A., Clay K. L., Sullivan J. B., Lepoff R.: Organic acids in ethylene glycol
intoxication. Am. Int. Med. 1986, 105, 16. -14. McChesney E. W., Golberg L.:
Reapraisal of the toxicology of ethylene glycol IV. The metabolism of labelled
glycolic and glyoxalic acid in The Rhesus Mankey. Fd. Cosmet. Toxicol. 1970,
10, 655. -15. Sperelakis N.: Physiology and Pathophysiology of the Heart. Sec
ed. Kluwer Academic Publishers. Boston Dordrecht Lancaster 1989. -16. Lacerda
P. R., Kniriem H. J., Bozner A.: Die Ultrastruktur des Herzmuskules der Ratte
nach akuter Alkoholintoxicationem. Z. Kreisl. Forschr. 1969, 58, 97. -17. Robbins
Pathologic Basis of Disease 5th ed. 1994, 540. -18. Zlatewa M., Angelow A.:
Ultrastructural changes in the undamaged areas of the myocardium in rats with
ischaemic-metabolic cardiomyomathy. Zentralbl. Allg. Pathol. 1980, 124, 136.
Adres pierwszego autora:
Katedra Patomorfologii Klinicznej
ul. Żeromskiego 113
90-549 Łódź
Print
