Ewa Pufal, Marzena Sykutera, Karol Śliwka

Oznaczanie bromochlorodifluorometanu (Halon 1211) w materiale biologicznym metodą
chromatografii gazowej z detektorem masowym (GC/MS)

Determination of bromochlorodifluoromethane (Halon 1211) in biological material by gas chromatography with mass detector

Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Bydgoszczy

Kierownik: prof. dr hab. K. Śliwka

W pracy przedstawiono metodę oznaczania bromochlorodifluorometanu (Halon 1211) w materiale biologicznym (krew, wycinki narządów wewnętrznych) metodą chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią masową (GC/MS). Po inkubacji prób w temperaturze 65^oC, po 15 minutach pobierano 10 ľl powietrza znad roztworu, który analizowano z wykorzystaniem kolumny kapilarnej DB-5ms (30m x 0,25mm x 0,25ľm). Analizę ilościową wykonano w opcji monitorowania pojedyńczych jonów (SIM) - m/z 85 i m/z 87. Opracowaną metodę wykorzystano w celu oznaczenia stężenia bromochlorodifluorometanu w materiale biologicznym pobranym ze zwłok mężczyzny, którego zgon nastąpił wskutek odurzania się zawartością gaśnicy halonowej.

A gas chromatographic metod with mass spectrometry has been developed for the determination of bromochlorodifluoromethane (Halon 1211) in biological material (whole blood, organ samples). After incubation of the sample (temp.65^oC, 15 min), 10 ľl of the headspace is analysed using a capillary column DB-5ms (30m x 0,25mm x 0,25ľm). Quantitative analysis was made with the use of a single ion monitoring option - m/z 85 and m/z 87. This developed method was used to determine the concentration of bromochlorodifluoromethane in biological material collected from the body of the man whose death was due to intoxication of halon 1211 - fire-extinguisher contents.

Słowa kluczowe: bromochlorodifluorometan, halon 1211, chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią masową, materiał biologiczny

Key words: bromochlorodifluoromethan, halon 1211, gas chromatography with mass spectrometry, biological material

Wstęp

W środowiskach młodzieżowych notowane są coraz częstsze przypadki zażywania narkotyków. Jednakże brak pieniędzy na zakup narkotyków powoduje, że młodzi ludzie szukają środków zastępczych. Szczególnym obiektem zainteresowania stają się ogólnie dostępne i tanie środki inhalacyjne takie jak rozpuszczalniki organiczne (toluen, ksylen, benzen, aceton) oraz inne substancje lotne (3, 4). Również halon 1211 (bromochlorodifluorometan, R12V1, R12B1, Freon 12V1, BCF) bezbarwny, bezwonny, niepalny, mało toksyczny gaz, aktywny składnik gaśnic halonowych jest stosowany w celu odurzania się (1, 2, 7, 8). W literaturze opisano kilka przypadków zgonów wskutek odurzania się zawartością gaśnic halonowych (1, 5, 8).

Z danych literaturowych wynika, że najczęściej stosowaną metodą oznaczania lotnych substancji organicznych w tym między innymi halonu 1211 w płynach biologicznych oraz tkankach jest chromatografia gazowa z wykorzystaniem detektora ECD-FID (6, 8) oraz detektora masowego (7). Analizy przeprowadzano z użyciem kolumny pakowanej wypełnionej 0,3% Carbowaxem na Carbopacu (6), kolumny kapilarnej SPB-1 (8) bądź kolumny kapilarnej typu OV-101 (7).

W dostępnej literaturze nie znaleziono publikacji w której do oznaczenia halonu 1211 wykorzystano by kolumnę kapilarną DB-5ms. Dlatego też celem niniejszej pracy było badanie przydatności chromatografii gazowej z detektorem masowym z użyciem kolumny kapilarnej DB-5ms do identyfikacji i oznaczania halonu 1211 w materiale biologicznym pobranym ze zwłok.

Opracowaną metodę wykorzystano w celu oznaczenia stężenia halonu 1211 w materiale biologicznym pobranym w czasie sekcji zwłok mężczyzny, który odurzał się zawartością gaśnicy halonowej. W trakcie odurzania się zawartością gaśnicy mężczyzna zasłabł i pomimo podjętej akcji reanimacyjnej zmarł.

Materiał i metoda

1. Przygotowanie standardu wewnętrznego

Jako standardu wewnętrznego (IS) użyto 1,1,1-trichloroetanu firmy Sigma-Aldrich. Standard wewnętrzny sporządzono przez rozpuszczenie 100 ľl 1,1,1-trichloroeteanu w 100 ml etanolu 99,8% (Merck). Standard przechowywano w szklanej butelce w temp. - 10 ^oC.

2. Sporządzenie krzywej kalibracyjnej

Przygotowano roztwory wzorcowe halonu 1211 (Sigma-Aldrich) we krwi oraz w wycinkach nerki o stężeniach 0,5 mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 20 mg/L. W fiolkach z korkiem silikonowym umieszczono po 5 ml (5 g) poszczególnych roztworów wzorcowych i dodano po 100ľl standardu wewnętrznego, a następnie ogrzewano w bloku grzewczym (Techne DB A2) w temp. 65^oC. Po 15 min. pobierano po 10 ľl powietrza znad roztworu i nastrzykiwano na kolumnę chromatograficzną.

3. Przygotowanie próbek materiału biologicznego pobranego ze zwłok

Do fiolek o poj. 10 ml dodano po 100 ľl standardu wewnętrznego oraz odpowiednio 5 ml (5 g) materiału biologicznego (krew, wycinki nerki, wątroby, mózgu, płuca, treść żołądka) pobranego ze zwłok mężczyzny, którego zgon nastąpił wskutek odurzania się zawartością gaśnicy halonowej. Fiolki zamknięto silikonowym korkiem i ogrzewano w bloku grzewczym (Techne DB A2) w temperaturze 65^oC, po 15 minutach pobierano 10 ľl powietrza znad roztworu i nastrzykiwano na kolumnę chromatograficzną.

4. Warunki analizy halonu 1211 metodą chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrem masowym

Analizę przeprowadzono z wykorzystaniem chromatografu gazowego AutoSystem XL, sprzężonego z detektorem masowym TurboMass firmy Perkin-Elmer oraz z wykorzystaniem biblioteki widm masowych Willey’a i NIST. Chromatograf wyposażony był w system elektronicznej kontroli przepływu gazu nośnego (hel 5,5), komorę nastrzykową (injector) typu split - splitless. Analizę chromatograficzną przeprowadzono na kolumnie DB-5 ms (30 m x 0,25 mm x 0,25 ľm). Rozdziału chromatograficznego dokonano w warunkach: temperatura injectora: 150^oC, temperatura linii transferowej: 175^oC, temperatura detektora: 175^oC, program temperaturowy pieca chromatografu: temperatura początkowa 35^oC utrzymana przez 1,75 min, następnie wzrost z szybkością 20^oC/min do 150^oC utrzymano przez 5 min, przepływ gazu nośnego: liniowy 35 cm/s. Analizę przeprowadzono w zakresie mas m/z 35-250. Analizę ilościową wykonano w opcji monitorowania wybranych jonów (SIM) - m/z 85, 87 (dla halonu 1211) oraz m/z 95, 97 (dla IS).

Wyniki

Na rycinie 1 przedstawiono chromatogram otrzymany w wyniku analizy (w pełnym zakresie wartości m/z 35-250) próby krwi zawierającej halon 1211. Czas retencji dla halonu 1211 wynosił 1,56 min a dla IS 2,59 min. Widmo masowe halotanu 1211 przedstawia rycina 2.

W ramach opracowania metody przeprowadzono proces walidacji oznaczania bromochlorodifluorometanu w materiale biologicznym uwzględniając takie parametry jak: zakres liniowości, granica oznaczalności i precyzja.

Wykresy kalibracyjne wykonano dla prób krwi i wycinków nerki wzbogaconych halonem 1211 w stężeniach 0,5 mg/L, 1,0 mg/L, 2,0 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 20 mg/L oraz standardem wewnętrznym. Uzyskano zadowalającą liniowość w wymienionym zakresie stężeń: współczynnik korelacji ® dla krwi 0,993, dla wycinków nerki 0,992. Powyższy zakres stężeń stanowi również zakres liniowości metody. Granica oznaczalności (LOQ) została obliczona w oparciu o stosunek sygnału do szumu (S/N=3). Jako LOQ dla halonu 1211 przyjęto 0,5 mg/L. Granica wykrywalności (LOD) wyznaczono jako połowę LOQ czyli 0,25 mg/L (tabela I).

Ryc. 1. Przykładowy chromatogram próby krwi

Fig. 1. Mass chromatogram of blood sample.

Ryc. 2. Widmo masowe halonu 1211.

Fig. 2. Mass spectrum of halon 1211.

Tabela I. Parametry walidacyjne oznaczania bromochlorodifluorometanu we krwi oraz wycinkach nerki.

Table I. Validation parameters of determination bromochlorodifluoromethane in blood and kidney sample.

Precyzję międzygrupową, wyrażoną jako względne odchylenie standardowe, wyznaczono poprzez czterokrotną analizę prób krwi i wycinków nerki wzbogaconych bromochlorodifluorometanem w stężeniu 2 mg/L powtarzaną co dwa dni.

Tabela II. Precyzja międzygrupowa.

Table II. Interday precision.

Precyzję wewnątrzgrupową, wyrażoną jako względne odchylenie standardowe, wyznaczono przez czterokrotną analizę prób przeprowadzoną tego samego dnia.

Tabela III. Precyzja wewnątrzgrupowa.

Table III. Intraday precision.

Międzygrupowa precyzja oznaczania halonu 1211 we krwi i w wycinkach nerki wynosi odpowiednio 2,9% i 3,4% natomiast precyzja wewnątrzgrupowa wynosi 3,2% dla krwi i 4,3% dla wycinków nerki.

Tabela IV. Stężenie halonu 1211 w materiale sekcyjnym.

Table IV. Halon 1211 concentrations in autopsy material.

W tabeli IV przedstawiono wyniki analizy materiału biologicznego, pobranego ze zwłok mężczyzny, który odurzał się halonem wykorzystując gaśnicę halonową. Wyniki przeprowadzonej analizy wykazały obecność halonu 1211 we wszystkich badanych próbach z wyjątkiem wycinków płuc. Być może brak obecności halonu w płucach mógł być spowodowany faktem długotrwałej reanimacji.

Dyskusja

Analiza lotnych związków organicznych w materiale biologicznym z uwagi na właściwości fizykochemiczne tych związków napotyka wiele problemów analitycznych w toksykologii klinicznej i sądowej.

Poszukiwanie obecności środków używanych do inhalacji w tym halonu 1211 jest szczególnie ważne w sytuacjach, gdy materiał badawczy został pobrany ze zwłok w przypadkach osób ze środowiska podejrzanego o używanie narkotyków zmarłych śmiercią nagłą w nietypowych okolicznościach.

Jak wynika z danych literaturowych jako prostą i szybką metodę skryningową w analizie lotnych substancji organicznych w materiale biologicznym najczęściej stosowano chromatografię gazową z detektorem FID-ECD (6, 8). Ramsey i Flanagan (6) opracowali metodę analizy mieszaniny lotnych substancji organicznych w tym halonu 1211 we krwi z użyciem 2 m kolumny pakowanej 0,3% Carbowax 20M na Carbopack C. Wykorzystanie przez Streeta ze współ. (8) 60 m kolumny kapilarnej SPB-1 umożliwiło skrócenie czasu analizy i uzyskanie lepszych parametrów rozdziału mieszaniny lotnych substancji toksycznych.

Izolacja lotnych związków z materiału badawczego w obu przypadkach została przeprowadzona poprzez ogrzewanie prób w temperaturze 65^oC przez 15 minut (6) lub 30 minut (8).

Przedstawione przez Ramsey’a i Flanagana (6) oraz Streeta ze współ. (8) warunki analityczne były wykorzystywane do oznaczania halonu 1211 tylko w mieszaninach wzorcowych. Natomiast brak jest danych dotyczących wykorzystania tych metod w przypadkach zgonów, których przyczyną mogło być zatrucie halonem 1211.

Smeeton i Clark (7) opisali przypadki zatruć halonem 1211. Potwierdzenie zatrucia tym związkiem uzyskali przeprowadzając tylko analizę jakościową prób krwi z wykorzystaniem chromatografii gazowej z detektorem masowym z użyciem kolumny OV-101.

Z danych literaturowych nie wynika jakie w przypadku podanych metod analitycznych są granice oznaczalności, wykrywalności oraz zakres liniowości w odniesieniu do halonu 1211.

W niniejszej pracy izolację halonu 1211 z materiału biologicznego przeprowadzono podobnie jak Ramsey i Flanagan (6) ogrzewając próby badane w temp. 65^oC przez 15 minut. Analizę halonu 1211 wykonano wykorzystując podobnie jak Smeeton i Clark (7) chromatografię gazową z detektorem masowym, jednakże do badań użyto często stosowaną w analizie skryningowej kolumnę chromatograficzną DB-5 ms. Identyfikacji pliku chromatograficznego halonu 1211 dokonano na podstawie porównania czasów retencji analitu i odpowiadającego mu wzorca. Dzięki prowadzeniu analizy mas, w trybie skanowania całkowitego zakresu mas, możliwe było dodatkowo porównanie otrzymanych widm masowych z widmami masowymi wcześniej analizowanego wzorca i z biblioteką widm masowych NIST’a i Willey’a. Analizę ilościową halonu 1211 przeprowadzono monitorując charakterystyczne i intensywne jony m/z 85 i m/z 87 co umożliwiało analizę tego związku w zakresie stężeń 0,5-20 mg/L.

Wyniki przeprowadzonych badań dowodzą, że opracowana metoda umożliwia nie tylko potwierdzenie obecności halonu 1211 w materiale biologicznym lecz również jego ilościową analizę.

Wnioski

Przedstawiona w niniejszej pracy metoda analityczna z wykorzystaniem chromatografu gazowego z detektorem masowym może być wykorzystana w toksykologii sądowej do jakościowej i ilościowej analizy halonu 1211 w materiale biologicznym.

Wyniki analizy materiału biologicznego, pobranego ze zwłok mężczyzny, który odurzał się halonem 1211 wykazały obecność tego związku we wszystkich analizowanych próbach za wyjątkiem wycinków płuc w stężeniach 1,7-10,8 mg/L. Z uwagi na podjętą reanimację nie można wykluczyć, że stężenie tego związku w materiale biologicznym mogło być wyższe.

Piśmiennictwo

1. Heath M.J.: Solvent abuse using bromochlorodifluoromethane from a fire Extinguisher. Med. Sci. Law., 1986, 26, 33-34. -2. Hüttenheim S.H., Literaturstudie der Feuerlöschmittel Halon 1301 und 1211 sowie ihrer Zersetzungsprodukte. Zbl. Hyg. 1989, 189, 193-204. -3. Madea B., Musshoff F., Homocidal poisoning with halotane. Int. J. Legal Med., 1999, 113, 47-49. -4. Naschelsky M.B., Dix J.D., Adelstein E.H., Homicide faciliteted by inhalation of chloroform. J. Forensic Sci. 1995, 40, 134 -138. -5. Pufal E., Sykutera M., Bloch-Bogusławska E., Lis G., Śliwka K., Zgon w następstwie odurzania się Halonem 1211. Arch. Med. Sąd. Krym. 2000, 50, 169-174. -6. Ramsey J.D., Flanagan R.J., Detection and identification of volatile organic compounds in blood by headspace gas chromatography as an aid the diagnosis of solvent abuse. J. Chrom. 1982, 240, 423-444. -7. Smeeton W.M.I., Clark M.S., Sudden Death Resulting from Inhalation of Fire Extinguishers Containing Bromochlorodifluoromethane. Med.Sci.Law 1985, 25, 258-260. -8. Streete P.J., Ruprah M., Ramsey J.D.Flanagan R.J., Detection and Identification of Volatile Substances by Headspace Capillary Gas Chromatography to Aid the Diagnosis of Acute Poisoning. Analyst, 1992, 117, 1111-1127.

Adres pierwszego autora:

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej AM

85-094 Bydgoszcz

ul. M. Curie-Skłodowskiej 9

Print

• Prev
• Next